U87MG-vector en U87MG-EGFRvIII stabiele transfectantcellen werden 48 uur puma schoenen blootgesteld aan 100 ng / ml anisomycine en onderworpen aan de TUNEL-test om de mate van apoptose te bepalen. Het genereren en karakteriseren van de isogene cellijnen werden eerder beschreven [9]. (D) Western blotting geeft aan dat U87MG-vectorcellen een zeer laag niveau van endogene EGFR (hoger molecuulgewicht; 175 kD) tot expressie brengen, terwijl U87MG-EGFRvIII-cellen significante EGFRvIII (140 kD) -expressie bevatten. Dit wordt mogelijk toegeschreven aan caspase-gemedieerde splitsing na behandeling met staurosporine.

De resultaten in Fig. 4 geven aan dat, in GBM-cellen, EGFR / EGFRvIII en PUMA constitutief complex vormen onder ongestresste omstandigheden en dat het complex zelfs na behandeling met de apoptose-inductor, staurosporine (ST) in stand blijft. Deze waarnemingen werden gevonden in U87MG-EGFRvIII (bovenste paneel) en U87MG-EGFR (middenpaneel) stabiele transfectanten, evenals in T98G GBM-cellen puma sneakers die hoge niveaus van endogene EGFR (onderste paneel) tot expressie brengen. IgG van muis gebruikt als negatieve controles leverde geen signaal op, hetgeen de specificiteit van de test aangeeft. Het is merkbaar dat endogene EGFR-niveaus enigszins werden verlaagd door staurosporine in T98G-cellen (rechterpaneel).

PUMA wordt puma sneakers dames gesekwestreerd in het cytoplasma van EGFR- en EGFRvIII-expressie GBM en borstkankercellen, onafhankelijk van apoptotische stress. De omvang van PUMA mitochondriale translocalisatie, mtPUMA Index, wordt berekend zoals eerder beschreven in Materialen en methoden. (A) PUMA is primair gelokaliseerd in het cytoplasma van U87MG-EGFRvIII-cellen. U87MG-EGFRvIII-cellen behandeld met vehiculumcontrole, staurosporine (ST, 1 uM) of anisomycine (AN, 100 ng / ml) werden geoogst en gefractioneerd in mitochondriale en niet-mitochondriale fracties. Proteïne-extracten van beide fracties werden onderworpen aan western blotting om PUMA, a-tubuline (cytoplasmatische marker) en Cox IV (mitochondriaal eiwit) te detecteren.

Soortgelijke puma werkschoenen waarnemingen werden verder gevonden in T98G GBM-cellen die van nature EGFR tot expressie brengen (Fig. 5c). De bescheiden detectie van mitochondriaal PUMA in deze cellen kan mogelijk het gevolg zijn van onvoldoende cytoplasmatische EGFR om te interageren met en alle PUMA-moleculen in het cytoplasma te sekwestreren. Belangrijk is dat siRNA-gemedieerde knock-out van EGFR-expressie leidde tot een significante toename (16-voudig) van mitochondriale PUMA (Fig. 5c-links), wat verder suggereert dat EGFR in staat is PUMA mitochondriale translocalisatie te moduleren. EGFR-specifiek siRNA was effectief bij het verminderen van EGFR-expressie zoals getoond door de western blots (Fig. 5c-rechts).

EGFR-kinase-activiteit is niet vereist voor hun interactie met PUMA. U87MG-EGFR-cellen behandeld met en zonder Iressa (25 uM) gedurende 2 uur werden onderworpen aan immunoprecipitatie / western blotting (linker paneel) en western blotting (rechter paneel). Controle IgG leverde geen signalen op die specificiteit aangeven. Behandelingen met Iressa remden effectief EGFR-kinase-activiteit, maar hadden geen significante invloed op de interactie tussen EGFR / EGFRvIII en PUMA, hetgeen aangeeft dat de interactie geen puma voetbalschoenen EGFR-kinase-activiteit vereiste. (C) Anti-apoptotische eiwitten Bcl-2 en Bcl-xL komen sterk tot expressie in de meeste GBM-cellijnen.

Western blotting werd uitgevoerd om expressieniveaus voor anti-apoptotische leden van de Bcl-2-familie van eiwitten te bepalen. Blijkbaar komen Bcl-2 en Bcl-xL sterk tot expressie in de meerderheid van de geanalyseerde GBM-cellijnen, maar niet Mcl-1. (D) Herstel van intrinsieke apoptose sensibiliseert EGFR / EGFRvIII tot expressie brengende GBM-cellen voor EGFR-gerichte therapie. U87MG-EGFR- en U87MGEGFRvIII-cellen werden behandeld met alleen Iressa (0-100 uM), 2-MA A3 (een Bcl-2 / Bcl-xL-remmer en een krachtige apoptose-inductor; 0-100 uM) alleen en in combinatie met de molverhouding van 1: 2 (Iressa: 2-MA A3).